本发明提供一种利鼻片的制备方法，由黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得黄芩素含量有很大提高，本发明还提供了利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用。
1.一种利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于利鼻片由黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g作为原料药制成，制备方法由下列步骤组成：取辛夷、薄荷、细辛，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。
2.根据权利要求1所述一种利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于制备方法中所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述一种利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于制备方法中所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
4.根据权利要求1所述一种利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于制备方法中所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种利鼻片的制备方法及应用。xa0
背景技术
利鼻片记载于卫生部标准WS3-B-0746-91，由黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g作为原料药制成，能清热解毒，祛风开窍。用于鼻渊、鼻塞流涕。xa0现有技术中，尚未有利鼻片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而采用打粉和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。xa0
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利鼻片的制备方法。xa0本发明的另一个目的在于提供一种利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用。xa0技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：xa0一种利鼻片的制备方法，由黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取辛夷、薄荷、细辛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。xa0上述一种利鼻片的制备方法，所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。xa0上述一种利鼻片的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。xa0上述一种利鼻片的制备方法，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。xa0上述利鼻片在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用。xa0现有技术中，利鼻片每片0.5g，每次4片，一日2次，采用本发明制备成的利鼻片每片0.5g，每次仅需2片，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。xa0试验一、不同方法制备的利鼻片中黄芩素含量的比较xa01、仪器及试药本发明利鼻片：按实施例3方法制备，使用1000g原料药，经提取制成1000片，每片重0.5g。原利鼻片，按部颁标准方法制备，使用1000g原料药，经提取制成1000片，每片重0.5g。Agilentxa01200高效液相色谱仪；METTLERxa0AE240电子分析天平；黄芩素对照品(中国药品生物制品检定所)。xa02、方法xa0色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸（40：60：0.2）为流动相；检测波长为280nm。理论板数按黄芩素峰计算，应不低于3000。xa0对照品溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩素对照品适量，加甲醇制成每1ml含18μg的溶液，即得。xa0供试品溶液的制备：取本发明利鼻片和原利鼻片，研细，混匀，取1g，精密称定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超声处理10分钟，离心，取上清液，即得。xa0测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。xa03、结果xa0结果表明，本发明利鼻片中黄芩素的含量为1.23mg/片；而原利鼻片中黄芩素的含量为0.21mg/片，在服用量减少的情况下，黄芩素含量有很大提高。xa0上述研究表明，采用本发明制备的利鼻片，有效成分含量高于部颁标准法制备的利鼻片。xa0
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。xa0实施例1xa0取黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g，将辛夷、薄荷、细辛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1m1/gxa0生药·min，萃取时间150min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。xa0经检测，成品中黄芩素的含量为1.28mg/片。xa0实施例2xa0取黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g，将辛夷、薄荷、细辛，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO₂流量3m1/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。xa0经检测，成品中黄芩素的含量为1.34mg/片。xa0实施例3xa0取黄芩100g、苍耳子150g、辛夷100g、薄荷75g、白芷100g、细辛25g、薄公英500g，将辛夷、薄荷、细辛，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2m1/g生药·min，萃取时间160min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。xa0经检测，成品中黄芩素的含量为1.23mg/片。xa0实施例4：利鼻片抑制M14细胞增殖的实验研究资料xa01实验材料xa01.1实验用细胞株xa0人黑色素瘤细胞M14细胞，南京正宽医药科技有限公司实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。xa01.2实验药物xa0研究药物：本发明利鼻片：按实施例3方法制备。xa0药液储液：称取100mg利鼻片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μlxa0doff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。xa01.3实验试剂xa0DMEM（GIBCO公司Cat.No.12100-061xa0Lot.No.758137）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO3（上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033xa0Lot.No.1088387）；Trypsin（AMRESCO公司批号：2010/04）；EDTA（AMRESCO公司批号：2009/10）；Penicillinxa0Gxa0Sodiumxa0Salt（AMRESCO公司批号：2010242）；Streptomycinxa0Sulfate（AMRESCO公司批号：2010382）；无水乙醇（南京化学试剂有限公司批号：080310182）；MTT(Biosharp批号：0793);PBS（实验室自配）；1.4实验器材xa0莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAXxa0190）；CO2培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Spring公司型号：S/Nxa0020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A）；冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI）；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。xa02实验方法xa01）M14细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3mlxa00.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。xa02）将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中（37℃，5%CO2）常规培养。xa03）根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入利鼻片溶液，继续培养24h。xa04）24h后加入20μlxa0MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。xa05）4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上xa0低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6）同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。xa07）结果以药物对细胞的抑制率表示：xa0细胞增值抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值×100%。实验重复3次。xa03统计处理xa0采用Microsoftxa0Excelxa02003软件中的相关分析和Studentxa0t检验，数据以mean±S.D.表示。xa04实验结果xa0MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对M14细胞增殖抑制有差异（P<0.05），剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P<0.01），当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P<0.001）。xa0表1利鼻片对M14细胞增殖抑制影响研究ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="165"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="483"/>注：与对照组比较，^*P<0.01；^**P<0.001xa05实验结论xa0利鼻片可以抑制M14细胞增殖，减少M14细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。xa0